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            蛋白質純化的主要方法及注意事項

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            蛋白質的分離純化在生物化學研究應用中使用廣泛,是一項重要的操作技術。 一個典型的真核細胞可以包含數以千計的不同蛋白質,一些含量十分豐富,一些僅含有幾個拷貝。為了研究某一個蛋白質,必須首先將該蛋白質從其他蛋白質和非蛋白質分子中純化出來。


            主要方法

            1.蛋白質的選擇吸附分離(利用顆粒不同程度的顆粒吸附力來使分離的目的達到)。

            2.按照配體特性的分離-親和層析(利用蛋白質分子與另一種稱為配體的分子能夠特異結合這一生物性質)

            3.低溫有機溶劑沉淀法,使用如甲醇,乙醇或丙酮等與水可混溶的有機溶劑,降低多數蛋白質的溶解度并且將其析出,和鹽析相比較,這種方法的分辨率更加的高,然而蛋白質比較容易變形,需要在低溫下進行。


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            4.按照分子大小不一樣的方法,密度梯度離心(在介質中對蛋白質離心時,蛋白質沉降速度取決于它的質量和密度,質量和密度越大,那么沉降越快;凝膠過濾(一種柱層析);超過濾(利用蛋白質分子不能從半透膜通過的性質)。

            5.按照溶解度差異分離,等電點沉淀法鹽溶與鹽析(使用一定濃度鹽溶液來使蛋白質的溶解度增大或減小);(因為在等電點時蛋白質分子的凈電荷為0,使分子間靜電斥力減少了,所以,聚集沉淀比較容易,這時具有最小的溶解度)。

            6.按照電荷不同的分離方法。主要分為離子交換層析和電泳分離。


            注意事項

            1.為了避免蛋白質變性,不要對樣品劇烈攪動和反復凍融。

            2.緩沖溶液成分盡量模擬細胞內環。。

            3.為了避免蛋白質的氧化,將0.1~1mmol/LDTT(二硫蘇糖醇)(或β-巰基乙醇)加入到緩沖溶液中。

            4.為了避免重金屬對目標蛋白的破壞,將1~10mmol/LEDTA金屬螯合劑加入。

            5.為了避免微生物生長,使用滅菌溶液。在純化任何一種蛋白質的時候,均必須時刻對它的穩定性注意維護,使它的活性得到保護,需要牢記如下一些通用的注意事項。

            6.盡可能置于冰上或者在冷庫內進行操作

            7.蛋白濃度不要太稀。

            8.除非是進行聚焦層。否則pH需要合適,防止所使用的緩沖溶液pH與pI相同,使蛋白質的沉淀得以避免。

            9.使用蛋白酶抑制劑,避免蛋白酶對目標蛋白的降解;在純化細胞中的蛋白質時,將DNA酶加入來使得DNA降解,避免DNA對蛋白的污染。


            2019-08-02 17:07:54 瀏覽次數:88次
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